样品的处理：取家兔一只，为保证取血量，取其颈动脉血，按1:1加入抗凝剂肝素（1250U/ mL）或适宜浓度的柠檬酸钠溶液（将6ｇ柠檬酸钠溶于100 mL的生理盐水中），若要过夜，温度须控制在4 ℃左右。在样品处理的流程中，第一步用到低速离心，而第三步用到高速离心，这主要是因为血液中除有红细胞外，还有其他细胞及大量的物质，红细胞与这些物质之间的密度存在较大的差异，用低速离心就能将他们分离开；而“分离血红蛋白溶液”步骤中，溶液的主要成份的密度相对要接近些，因此需要用较高速的离心，才能将这些物质初步分离。
搅拌好的混合液离心后明显分为4层（如右图），由上至下依次是甲苯层、脂溶性物质的沉淀层、血红蛋白的水溶液、红细胞破碎物沉淀。取其上清液，用滤纸过滤除去脂类，再使滤液在分液漏斗中静置5min，出现分层，分离出下层的血红蛋白溶液。
粗分离：将血红蛋白溶液装入规格为7000D的透析袋，按1:300的比例放入20mmol/L的磷酸盐缓冲液（pH为7．0），透析12h。透析的目的一是为了除去小分子蛋白质，二是使血红蛋白处于缓冲液环境中，便于后续的磷酸缓冲液在凝胶柱中进行洗脱。
纯化：可采用柱型为Sephadex G75，柱体积为500 mL的色谱柱；加样量为10 mL（约含蛋白200 m g）；用20mmol/L的磷酸盐缓冲液（pH为7．0）进行洗脱，洗脱速度可控制为0．5 mL /min，即20 min /管。此时可用A280的紫外线进行检测，如果测得的数值很高，说明蛋白含量过高，此时需要进行稀释。下图是将每管取0．5 mL稀释10倍后，用紫外线测量的结果（如下图）。
由图中数值可知，33-38管对应的数值为血红蛋白的吸收值，选择此时的试管进行蛋白质纯度的鉴定是比较合适的。
纯度鉴定：经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定，以下是实验操作流程。
脱色的目的是脱去背景颜色以体现出蛋白条带。一般来说，条带分明，目的条带清晰，无扩散，前沿比较直，说明实验结果比较好，样品比较纯，下面为兔血实验的电泳结果图。
5.课时安排及实施建议
本课题可安排4～5课时。教师可在实验前配制好磷酸缓冲液，并购买或制作好凝胶色谱柱，以备实验时使用。
课时安排
授课或实验内容
补充说明
第1～2课时
讲授凝胶色谱法和电泳的基本原理
透析和平衡凝胶需要的时间较长，可由教师完成；
电泳可由教师演示完成
第3课时
进行样品的处理（洗涤、释放、分离和透析）
第4课时
运用凝胶色谱法对血红蛋白进行纯化
增加1课时
通过聚丙烯酰胺凝胶电泳对提取的蛋白质进行纯度鉴定
由于大多数学校缺乏相应的实验设备，操作难度较高，因此，本实验可由教师以讲清实验原理和演示操作为主，并配以相应的实验录像进行教学。
6.教学体会
本课题的实验操作相对复杂，影响实验效果的关键环节之一是凝胶色谱柱的制作和装填，对实验者的操作有很高的要求，建议有条件的学校直接购买商品色谱柱。由于甲苯是剧毒试剂,不太适合在中学实验中使用，因此，我们尝试在血红蛋白的释放时，只使用蒸馏水使细胞涨破,也获得了很好的实验效果。电泳过程中制胶、染色和脱色耗时较多，建议由教师完成，其他环节由师生共同完成。此外，本课题也可选用鸡血或猪血作为实验材料。
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